Секвенирование

Сравнение с генотипированием с использованием микрочипов

Существует множество технологий для поиска генов, связанных с заболеваниями. Каждая из них имеет свои ограничения по выходу, финансовым затратам, техническим потребностям. Например, методы микрочипирования требуют зондов для гибридизации с известной последовательностью, поэтому они ограничены в области разработки зондов и не позволяют выявить некоторые генетические изменения. Технологии высокопроизводительного секвенирования, используемые для секвенирования экзома, позволяют узнать последовательности тысяч локусов одновременно и определить неизвестные до сих пор источники многих болезней. Эта технология позволяет обойти ограничения генотипирующих чипов и классического секвенирования.

Секвенирование экзома — процедура более дорогая, чем использование генотипирующих чипов, но она позволяет охватить гораздо больше генов. По мере уменьшения финансовых затрат и увеличения производительности методов геномного секвенирования этот метод все шире используется в практике для работы с редкими генетическими заболеваниями. Накапливающиеся в ходе экзомного секвенирования данные требуют тщательного анализа. Программы для анализа данных экзомного секвенирования постоянно совершенствуются. Различные платформы секвенирования различаются по характеристикам получаемых данных: различаются длины полученных чтений, уровень ошибок, могут использоваться парные и непарные чтения. Все это должно быть учтено при сборке и анализе результатов

Этим различиям нужно уделить особое внимание при сравнении результатов, полученных с использованием разных методов подготовки образцов и секвенирования.

История

В 1995 году впервые была предложена идея нанопорового секвенирования — определение свойств линейного полимера при его протаскивании через пору в мембране. При прохождении через пору полимер определённым образом с ней взаимодействует, что позволяет определить его свойства. Спустя год — в 1996 году — появилась первая работа, описывающая возможность применения нанопор (в качестве нанопоры был использован ) для определения характеристик нуклеиновых кислот.

В 1999—2000 годах была показано, что, используя в качестве нанопоры альфа-гемолизин стафилококка, можно отличить одноцепочечную РНК от одноцепочечной ДНК.

В 2001 году впервые была проведена работа, в которой с помощью нанопор определяли наличие коротких последовательностей ДНК. Только к 2009 году удалось показать необходимую для создания методов секвенирования возможность различать нанопорами все основания в последовательности ДНК.

В 2012 году компанией были продемонстрированы первые нанопоровые секвенаторы: GridION и MinION.

Тогда же была показана принципиальная возможности применения данного метода — был секвенирован геном бактериофага phiX длиной 5,4 тысячи пар оснований (п. о.).

Примечания

1. ↑ . www.bioinformatics.babraham.ac.uk. Дата обращения 27 апреля 2019.
2. ↑
3. . bio-bwa.sourceforge.net. Дата обращения 27 апреля 2019.
4. . broadinstitute.github.io. Дата обращения 27 апреля 2019.
5. ↑
6. ↑
7. ↑
8. . igv.org. Дата обращения 27 апреля 2019.
9. ↑ . software.broadinstitute.org. Дата обращения 2 мая 2019.
10. ↑ . miso.readthedocs.io. Дата обращения 27 апреля 2019.
11. . software.broadinstitute.org. Дата обращения 27 апреля 2019.
12.  (англ.). Дата обращения 27 апреля 2019.
13.  (англ.). Дата обращения 2 мая 2019.
14. . bioinfo.au.tsinghua.edu.cn. Дата обращения 2 мая 2019.
15. . bioviz.org. Дата обращения 2 мая 2019.
16. ↑ . bioinfolab.muohio.edu. Дата обращения 2 мая 2019.
17.  (англ.). The Artemis Software. Дата обращения 3 мая 2019.
18.  (англ.). Apollo. Дата обращения 3 мая 2019.
19.  (англ.). bamview.sourceforge.net. Дата обращения 3 мая 2019.
20. . victorian-bioinformatics-consortium.github.io. Дата обращения 3 мая 2019.
21. . gmod.org. Дата обращения 3 мая 2019.
22.  (англ.). genomeview.org. Дата обращения 3 мая 2019.
23. . code.google.com. Дата обращения 3 мая 2019.
24. . compbio.cs.toronto.edu. Дата обращения 3 мая 2019.
25.  (англ.). Bioconductor. Дата обращения 3 мая 2019.
26.  (англ.). Bioconductor. Дата обращения 3 мая 2019.
27. . fluff.readthedocs.io. Дата обращения 3 мая 2019.

Применение экзомного секвенирования

Используя экзомное секвенирование, в ходе исследований с фиксированными затратами мы можем секвенировать последовательности с существенно большей глубиной покрытия по сравнению с покрытием, получаемым методами полногеномного секвенирования. Благодаря этому экзомное секвенирование чаще используется при решении задач, требующих надежного определения однонуклеотидных полиморфизмов.

Клиническая диагностика

29 сентября 2011 года компания Ambry Genetics стала первой сертифицированной компанией, предлагающей секвенирование экзома и диагностику заболеваний на его основе. В компании утверждают, что результаты экзомного секвенирования позволят сотрудникам диагностировать заболевания, при которых традиционные диагностические подходы неприменимы.

Идентификация мутаций, вызывающих заболевания, может внести существенный вклад в диагностические и терапевтические подходы, поможет прогнозировать развитие заболевания и позволит тестировать родственников, находящихся в зоне риска. Есть несколько факторов, на основании которых экзомному секвенированию отдается предпочтение перед моногенным анализом: возможность идентифицировать мутации в генах, не подвергшихся тестированию ввиду нетипичного клинического проявления и идентификация клинических случаев, при которых мутации в разных генах вызывают различные проявления у одного и того же пациента. Кроме того, метод позволяет диагностировать заболевания на ранних этапах и у молодых пациентов до проявления всего спектра характерных симптомов; он также используется для пренатальной диагностики В некоторых случаях пренатальное секвенирование экзома позволяет выявить генетические заболевания, в то время как стандартные методы (кариотипирование и использование микрочипов) оказываются неэффективны.

Авторы важнейшей рецензированной публикации об экзомном секвенировании подчеркивают полезность этого метода для клинической практики. Авторы, применившие экзомное секвенирование для идентификации мутации, вызывающей синдром Барттера и , заявляют: «Мы видим будущее, в котором подобная информация станет частью повседневной клинической оценки пациентов с подозрениями на генетические заболевания с неясным диагнозом… Мы предвидим, что полноэкзомное секвенирование внесет огромный вклад в понимание того, какие гены и какими путями участвуют в развитии редких и частых человеческих болезней, а также в клиническую практику».

Картирование редких полиморфизмов при комплексных расстройствах и менделевских болезнях

Текущие крупные международные исследования направлены на определение в геноме частых полиморфизмов, которые легче всего идентифицировать современными методами. Однако из-за отрицательного отбора полиморфизмы, вызывающие крайне тяжелые заболевания, в частности, менделевские болезни, встречаются с существенно меньшей аллельной частотой и могут остаться невыявленными в ходе поиска генов-кандидатов при использовании современных стандартных методов , при этом чаще всего они расположены в границах экзома. Так как при комплексных расстройствах с риском заболевания связано большое количество генов, для обнаружения их необходимы исследования очень большой выборки, поэтому, с точки зрения издержек, полногеномное секвенирование не является оптимальным. К тому же, полиморфизмы в кодирующих областях изучаются очень подробно, и их функциональное значение проще определить Успешная модель идентификации менделевских генов включает определение возникающих полиморфизмов при секвенировании генов двух родителей и потомка.

Использование в сельском хозяйстве

Геномы растений могут быть чрезвычайно сложными, повторяющимися и часто полиплоидными; в результате некоторые из наиболее экономически важных культур не удается исследовать с использованием полногеномного секвенирования. Разработан набор для обогащения экзома пшеницы на основе накопленных данных транскриптома, с использованием которого были проведены исследования нежелательной внутрикультурной экзома, влияющей на фенотип растения, в частности, скорость роста, способность жить в различных условиях и другие важные для селекции признаки. Подобные же наборы были использованы при исследовании риса Oryza sativa и сои Glycine max. Также можно идентифицировать генетические маркеры, отвечающие за особую устойчивость растительных культур к определенным патогенам.

В ряде случаев секвенирование экзома может быть использовано как альтернатива более дорогому секвенированию полного генома, например, при исследовании генетических вариаций внутри и между популяциями.

«Допотопная» ДНК

«Допотопной» (англ. antediluvian) была названа ДНК старше 1 миллиона лет. Название было предложено в 1993 году Томасом Линдалом (Tomas Lindahl) в обзоре в Nature. В 1990-е годы появились сообщения о секвенировании ДНК, сохранившейся на протяжении миллионов лет в ископаемых остатках растений, костях динозавров и инклюзах в янтаре. Некоторые из этих результатов с большой вероятностью являются следствием контаминации, другие оказались невоспроизводимы. Например, в ответ на публикацию в Science о секвенировании фрагмента митохондриальной ДНК из кости динозавра мелового периода (80 млн лет назад), вышли заметки, в одной из которых было указано, что при построении филогенетического дерева последовательность из кости динозавра кластеризуется с человеческой, а не с ортологичным участком из мтДНК птиц или крокодила, что свидетельствует о большой вероятности контаминации; в другой заметке высказывалось предположение, что последовательность, приписанная динозавру, — это на самом деле древняя вставка мтДНК в человеческой хромосоме, попавшей в образец.

Для анализа необходимо предоставить:

• Контактное лицо
• Организацию
• Контактные телефоны
• Адрес электронной почты для пересылки результата.

Образцы необходимо присылать по почте на адрес:

127434, г. Москва, Тимирязевская ул., дом 42, каб. 352, ООО «Синтол».Для заказчиков из Москвы образцы могут быть переданы через нашего курьера по предварительной договорённости.

Секвенирование «эконом» – 168 ₽/образец

Уважаемые коллеги!
Если Вы хотите удешевить стоимость секвенирования, мы предлагаем Вам самостоятельно подготовить для секвенирования 96-луночную плашку, внеся в каждую лунку 3 пкмоль праймера и ДНК в рекомендуемых количествах (см. таблицу выше). Растворы желательно высушить. Стоимость секвенирования одной 96-луночной плашки – 16 130 руб.

Секвенирование «всё включено» – 3 455 ₽/образец

Уважаемые коллеги!
Если у вас нет возможности самостоятельно получать образцы для секвенирования или некогда этим заниматься, а секвенировать нужно срочно, то Вы можете воспользоваться нашей новой услугой – Секвенирование «всё включено». Стоимость услуги – 3 455 рублей за один образец складывается из следующих работ:

• подбор праймеров для амплификации – 1328 рублей;
• синтез прямого и обратного праймеров для амплификации – 1063 рубля;
• выделение ДНК из предоставленного материала – 398 рублей за образец;
• амплификация ДНК и очистка ПЦР-продукта – 201 рубль за образец;
• секвенирование – 465 рублей за образец

Фрагментный анализ ДНК – 168 ₽/образец

Коммерческое применение

Oxford Nanopore Technologies

В феврале 2012 года на конференции AGBT во Флориде компания Oxford Nanopore Technologies представила прототипы двух платформ для высокопроизводительного секвенирования длинных фрагментов, основанных на нанопоровом секвенировании целых цепочек: GridION и MinION. В качестве демонстрации был секвенирован геном бактериофага PhiX длиной 5386 п. о. На 2020 год компания выпускает несколько устройств. Все они позволяют анализировать данные в реальном времени

MinION

MinION — секвенатор небольшого размера с одноразовой ячейкой, спроектированный для использования в домашних условиях, с запланированной ценой около 900$. Секвенатор имеет разъём USB 3.0 для подключения к компьютеру. Содержит 512 нанопор со сходными характеристиками. Ячейка позволяет отсеквенировать до 30 миллионов п. о. ДНК (примерно за двое суток можно оцифровать 10—20 миллионов п. о. ДНК). В 2019 году компания начала выпускать Flongle — адаптор к MinION или GridION, который позволяет работать с менее производительными (~1 Gb, 126 нанопор вместо 512), но существенно более дешёвыми ($90) ячейками .

GridION

GridION — устройство, спроектированное для полногеномного секвенирования (по сути своей — MinION с увеличенной производительностью). Прототип имел 2000 отдельных нанопор, каждая из которых способна получать прочтения длиной до 5100 п. о. со скоростью 150 миллионов п. о./ч в течение 6 часов. GridION Mk1 стоит $49,955 и содержит 5 независимых ячеек. С помощью него за один эксперимент можно отсеквенировать до 150 миллионов п. о. ДНК.

PromethION

Самый высокопроизводительный секвенатор этой компании, позволяет секвенировать за один эксперимент несколько триллионов п. о. ДНК. PromethION 24 содержит 24 ячейки и способен за трое суток оцифровать 3,8 триллионов п. о. ДНК, PromethION 48 содержит 48 ячеек и способен за трое суток оцифровать 7,6 триллионов п. о. ДНК. Ячейки секвенатора содержат 3000 нанопор. Поток данных с такого количества нанопор не может анализироваться обычным компьютером, поэтому для использования этого секвенатора необходим суперкомпьютер (впрочем, если запускать только одну ячейку, то справится и обычный компьютер).

Другие разработки

Компания планирует выпустить ещё два устройства: SmidgION — секвенатор, который подключается к смартфону, и Plongle — секвенатор, который содержит 96 независимых, но малопроизводительных ячеек, и, соответственно, рассчитан на частые секвенирования большого объёма коротких ДНК.

Пост-обработка данных, полученных с помощью Oxford Nanopore

После использования продукции Oxford Nanopore на выходе имеются сырые данные формата FAST5. Формат FAST5, используемый Oxford Nanopore, — это вариант стандарта HDF5 с иерархической внутренней структурой, предназначенной для хранения метаданных, связанных с последовательностью ДНК и событий (агрегированные измерения общего тока), предварительно обработанных рабочим устройством. Результаты обработки отображаются в реальном времени в графическом интерфейсе MinKNOW, а данные записываются в формате файлов FASTQ или .fast5. Далее нужно произвести распознавание нуклеотидов (англ. base calling). Этот процесс обработает сырые данные формата FAST5 в формат FASTQ (в программе MinKNOW этот процесс можно запустить во время прочтения ридов). Также можно использовать такие программы, как poreTools, Guppy.

Далее нужно очистить полученные последовательности, чтобы избавиться от данных со слишком большим шумом. Для этой задачи используется, например, программа NanoFilt. Как только данные будут очищены, полученные данные дальше можно использовать для последующей сборки и анализа данных.

Перспективы

Работа над интерпретацией данных генома находится всё ещё в своей начальной стадии. Ожидается, что детальное знание человеческого генома откроет новые пути к успехам в медицине и биотехнологии. Ясные практические результаты проекта появились ещё до завершения работы. Несколько компаний, например «Myriad Genetics (англ.)», начали предлагать простые способы проведения генетических тестов, которые могут показать предрасположенность к различным заболеваниям, включая рак молочной железы, нарушения свёртываемости крови, кистозный фиброз, заболевания печени и многим другим. Также ожидается, что информация о геноме человека поможет поиску причин возникновения рака, болезни Альцгеймера и другим областям клинического значения и, вероятно, в будущем может привести к значительным успехам в их лечении.

Также ожидается множество полезных для биологов результатов. Например, исследователь, изучающий определённую форму рака может сузить свой поиск до одного гена. Посетив базу данных человеческого генома в сети, этот исследователь может проверить что другие учёные написали об этом гене включая (потенциально) трёхмерную структуру его производного белка, его функции, его эволюционную связь с другими человеческими генами или с генами в мышах или дрожжах или дрозофиле, возможные пагубные мутации, взаимосвязь с другими генами, тканями тела в которых ген активируется, заболеваниями, связанными с этим геном или другие данные.

Более того, глубокое понимание процесса заболевания на уровне молекулярной биологии может предложить новые терапевтические процедуры. Учитывая установленную огромную роль ДНК в молекулярной биологии и её центральную роль в определении фундаментальных принципов работы клеточных процессов, вероятно, что расширение знаний в данной области будет способствовать успехам медицины в различных областях клинического значения, которые без них были бы невозможны.

Анализ сходства в последовательностях ДНК различных организмов также открывает новые пути в исследовании теории эволюции. Во многих случаях вопросы эволюции теперь можно ставить в терминах молекулярной биологии. И в самом деле, многие важнейшие вехи в истории эволюции (появление рибосомы и органелл, развитие эмбриона, иммунной системы позвоночных) можно проследить на молекулярном уровне. Ожидается что этот проект прольёт свет на многие вопросы о сходстве и различиях между людьми и нашими ближайшими сородичами (приматами, а на деле и всеми млекопитающими).

Проект определения разнообразия человеческого генома (англ.) (HGDP), отдельное исследование, нацеленное на картирование участков ДНК, которые различаются между этническими группами. В будущем HGDP, вероятно, сможет получить новые данные в области контроля заболеваний, развития человека и антропологии. HGDP может открыть секреты уязвимости этнических групп к отдельным заболеваниям и подсказать новые стратегии для их преодоления (см. Раса и здоровье (англ.)). Он может также показать, как человеческие популяции адаптировались к этим заболеваниям.

Особые перспективы исследования генома человека открывают методы секвенирования нового поколения. В связи с развитием новых методов значительно упростился и ускорился процесс секвенирования генома. Это позволяет проводить секвенирование большого количества геномов человека для определения однонуклеотидного полиморфизма (проект 1000 геномов). Кроме того, секвенирование нового поколения позволило начать проект по картированию элементов генома (регуляторных и других последовательностей) — ENCODE.

Удешевление методов секвенирования уже сейчас позволяет определять последовательность генома отдельного человека в терапевтических целях.

История

Первая работа, описывающая возможность применения нанопор для определения характеристик нуклеиновых кислот, появилась в 1996 году.

В 1999—2000 годах была показана возможность отличать одноцепочечную РНК от одноцепочечной ДНК, используя .

В 2001 году впервые была проведена работа по распознаванию наличия или отсутствия коротких последовательностей ДНК с помощью нанопор. Только к 2009 году удалось показать возможность различать все основания в последовательности ДНК при использовании нанопор, необходимую для создания методов секвенирования.

В настоящий момент продемонстрировано принципиальное доказательство возможности применения данного метода — был секвенирован геном бактериофага phiX длиной 5,4 килобазы.

Цели метода и сравнение с другими подходами

Секвенирование экзома особенно эффективно для изучения редких менделевских заболеваний, так как это наиболее продуктивный путь для поиска генетических вариаций во всех генах индивида. Такие заболевания чаще всего вызваны очень редкими генетическими вариантами, которые встречаются лишь у очень небольшого числа людей.

В прошлом клинические генетические тесты выбирались на основе клинической картины заболевания (то есть фокусировались на одном или небольшом числе генов, для которых связь с конкретным синдромом была хорошо изучена), или исследовались только определённые типы генных вариантов. Такой подход позволял поставить определённые генетические диагнозы менее чем в половине случаев. Экзомное секвенирование все чаще используется дополнительно к другим тестам: для того чтобы найти новые мутации в генах, связь которых с конкретным заболеванием уже известна, а также чтобы обнаружить новые гены, связанные с заболеванием, методом сравнения экзомов пациентов со схожими признаками.

История

Технологическая платформа для быстрого широкомасштабного секвенирования была создана в 2005 году фирмами 454 Life Sciences и Illumina (ранее Solexa) и сначала использовалась для секвенирования геномов. Первые работы по секвенированию транскриптомов появились в 2008 году. В числе первых, были секвенированы транскриптом дрожжей, арабидопсиса и мыши.

В настоящее время РНК-секвенирование осуществляется в основном с использованием трех инструментальных платформ широкомасштабного секвенирования: Illumina, 454 Life Sciences и SOLiD.

В отличие от другого широкомасштабного метода анализа транскриптома — экспрессионных микрочипов, РНК-секвенирование позволяет получать данные о сплайс-вариантах транскриптов, редактировании, однонуклеотидных полиморфизмах, а также химерных генах. Кроме того, РНК-секвенирование позволяет получить абсолютную количественную информацию о представленности различных транскриптов в пробе, в отличие от относительных количественных данных микрочипов.

Применение

Секвенирование de novo

Длина чтений одномолекулярного секвенирования в реальном времени сравнима или больше, чем в методе Сэнгера, что даёт возможность секвенировать геномы и упрощает их сборку. Длинные чтения обеспечивают контекст, необходимый для правильного определения позиций повторов в геноме. Возможность получения длинных участков ДНК при секвенировании важна также для метагеномики: можно идентифицировать организмы в смешанных популяциях — например, в микробиоме. Поскольку для сборки генома необходимо меньшее количество прочтений одних и тех же участков, расшифровка генома таким методом требует меньших затрат. Одномолекулярное секвенирование в реальном времени было продемонстрировано на секвенировании геномов de novo в работах, посвящённых анализу вспышки кишечной инфекции в Германии в 2011 году и эпидемии холеры на Гаити в 2010 году.

Гибридная корректировка сборки геномов

Технология секвенирования «третьего поколения» в сочетании с более старыми методами позволяет увеличить точность сборки генома. Секвенаторы «второго поколения» способны считывать геном небольшими фрагментами протяженностью 100—700 пар оснований, но такие чтения затем сложно соединить в правильном порядке. Приборы «третьего поколения» (в частности, PacBio RS компании Pacific Biosciences) могут генерировать чтения длиной до 23 тыс. пар оснований, но делают больше ошибок, чем допустимо для обычного программного обеспечения для геномного анализа. В 2011 году учёные из центра (США) использовали короткие чтения, полученные в ходе секвенирования на приборах второго поколения Illumina и Roche 454, для корректировки ошибок в длинных чтениях, генерированных секвенатором PacBio RS. Протестировав разработанный алгоритм на геномах бактерии Escherichia coli и дрожжей, а также на транскриптоме кукурузы, исследователи выяснили, что точность сборки можно повысить с 83 до 99,9 %. Ученые также применили разработанный метод гибридной корректировки к сборке ранее несеквенированного генома волнистого попугайчика.

В 2012 году гибридный подход был использован для сборки генома штамма холеры, вызвавшего эпидемию на Гаити в 2010 году. Участки генома бактерии, важные с точки зрения лечения заболевания, были собраны с точностью, превосходящей 99,9 %.

Ресеквенирование и определение геномных вариаций

Одна и та же молекула ДНК может быть независимо ресеквенирована с помощью кольцевой ДНК-матрицы и фермента, отделяющего вновь синтезированную цепь ДНК от матрицы

Это имеет важное значение для анализа и диагностики различных заболеваний. Сравнивая миллионы и миллиарды чтений с исходным текстом, можно получить полный перечень отличий изучаемого генома от «золотого стандарта»

Более того, если каждая буква исходного текста проверяется многократными прочтениями, это увеличивает статистическую достоверность найденных генетических особенностей и аномалий.

Учёные компании Pacific Biosciences совместно со специалистами из других организаций использовали данный подход для обоснования гипотезы об активирующей тандемной дупликации FLT3 как терапевтической мишени при остром миелолейкозе. Данная технология также подходит для анализа транскриптома и сплайсинга, поскольку одно длинное чтение с секвенатора может содержать целую мРНК. Одномолекулярное секвенирование в реальном времени с высокой точностью позволяет детектировать однонуклеотидные полиморфизмы.

Расшифровка эпигенома

Кинетика реакции полимеризации в ходе секвенирования даёт возможность определять ключевые эпигенетические модификации ДНК. При одномолекулярном секвенировании в реальном времени о наличии метилированных нуклеотидов судят по изменению периода до следующей вспышки, так как метилирование влияет на активность полимеразы. Этот метод уже используется для определения , , а также . В 2012 году группа ученых использовала данный подход для анализа полного профиля метилирования 6 бактерий.

Секвенирование РНК

Используя вместо ДНК-полимеразы обратную транскриптазу, SMRT технология позволяет секвенировать РНК. Таким способом можно одновременно детектировать последовательность, модификации оснований, перестановки, влияющие на структуру РНК. Кинетика обратной транскрипции чувствительна также к вторичной структуре РНК, которая увеличивает вероятность долгих пауз или терминации в ходе реакции. Более того, SMRT секвенирование позволяет детектировать динамику рефолдинга РНК — например, в процессе обратной транскрипции ретровирусов или во время деградации мРНК экзосомами.

Этические вопросы

Новые технологии в сфере геномики изменили подход исследователей как в фундаментальной, так и в прикладной науке. Средства экзомного секвенирования позволили существенно повысить качество данных об индивидуальных геномах, что порождает ряд вопросов об использовании большого количества подобной информации. Необходимо ли предоставлять доступ к этой информации самим исследуемым индивидам или их страховым компаниям? Эти данные могут привести к неожиданным открытиям, что усложняет ответы на вопросы о клинической применимости метода и пользе для пациента. Исследователи ищут пути решения этих вопросов.

Варианты нанопорового секвенирования

В зависимости от того, сохраняют ли секвенируемые молекулы нуклеиновых кислот свою химическую целостность, выделяют два варианта — секвенирование целых цепочек и экзонуклеазное секвенирование.

Секвенирование целых цепочек

В данном методе цепи нуклеиновых кислот не расщепляются. Перенос целых молекул ДНК и РНК через пору может осуществляться следующими способами:

Транспорт под действием напряжения. Так как ДНК и РНК несут на себе отрицательный заряд, то самым простым способом транспорта молекулы нуклеиновой кислоты через пору является их электрофоретический перенос вместе с ионами. Проблемой данного метода является то, что для измерения падения тока ионов через пору изначально требуется большой ток, чтобы получить хорошее соотношение сигнал/шум. Но при увеличении приложенного напряжения увеличивается и скорость, с которой молекула нуклеиновой кислоты преодолевает пору, а значит уменьшается время распознавания каждого отдельного основания, из-за чего качество распознавания падает.

Транспорт под действием напряжения с расплетанием дуплексов. Уменьшить скорость прохождения одноцепочечной ДНК через пору можно, образуя с ней двухцепочечные участки с помощью комплементарных фрагментов ДНК. Тогда в ходе транспорта будет происходить расплетание данного участка, что и позволит дольше задерживать отдельные нуклеотиды в поре. Тем не менее, поскольку расплетание происходит не понуклеотидно, то время задержки нуклеотида в поре не является постоянным для всей последовательности.

Транспорт с использованием ферментов. Для того, чтобы каждый нуклеотид задерживался в поре на фиксированное время, можно использовать различные ферменты, которые будут пропускать нуклеотиды через пору по одному. Примером такого фермента является ДНК-полимераза. За счёт приложенного напряжения комплекс ДНК-фермент изначально притянут к поре. Но теперь, прежде, чем очередной нуклеотид молекулы ДНК пройдёт через пору, должен произойти один шаг синтеза второй цепи ДНК. Возникающая задержка оснований внутри поры позволяет более точно различать их.

Экзонуклеазное секвенирование

В данном методе цепь нуклеиновой кислоты нарезается на единичные нуклеотиды экзонуклеазой, расположенной в непосредственной близости от поры. Под действием поля отрицательно заряженные нуклеотиды самостоятельно попадают в пору, где происходит определение оснований.