Рнк-содержащие вирусы

Метод петлевой изотермической амплификации, LAMP

Метод петлевой изотермической амплификации, LAMP (от англ.Loop-mediated isothermal amplification) считается упрощенной ПЦР. Производители тест-систем обещают точность метода до 94%.

Во многом метод LAMP схож с ПЦР, за исключением ряда нюансов: праймеров требуется больше, амплификаторов (приборов, периодически изменяющих температуру) не требуется вовсе, как не требуется и электрофореза. РНК вируса также достраивается до ДНК, а дальше копирование идет при постоянной температуре и занимает всего 20-30 минут.

Чтобы увидеть результат, не требуется электрофорез, достаточно просто взглянуть на пробирку. Мутный осадок говорит о том, что в образце обнаружен вирус. Осадок частично состоит из ионов, освобождающихся из «букв»-нуклеотидов во время синтеза ДНК. Если он появляется, значит, ДНК вируса удалось размножить. Многие производители добавляют в свои тест-системы флуоресцентные красители ДНК, чтобы наличие или отсутствие вирусной частицы не вызывало сомнений.

Reuters

Механизм проникновения вируса в клетку

Большинство вирусов видоспецифичны и могут поражать только определенные виды хозяев и конкретные клетки-мишени. Вирусные белки в капсиде вируса могут иметь сродство к белкам на поверхности клетки. Для проникновения в клетку белки слияния вируса используют соответствующие белки оболочки клетки — рецепторы. Если вирус не находит подобный рецептор, заражения не случится. Именно поэтому коронавирусы не заражают через кожу: у ее клеток нет необходимых рецепторов.

Рецепторами могут выступать любые белки клеточной оболочки. Конечно, они созданы не для того, чтобы вирус мог за них зацепиться, а для решения других задач. Например, белок ACE2, который отвечает за регулирование давления крови у человека, оказался рецептором для коронавируса SARS-CoV-2. А несколько других важных для иммунного ответа организма белков стали рецепторами для ВИЧ.

После того как вирус зацепился за рецептор на клеточной оболочке, ему нужно попасть внутрь клетки. Это может происходить по двум основным сценариям: через эндоцитоз или напрямую через клеточную мембрану.

Рассмотрим первый случай на примере вируса гриппа. Когда вирус попадает на клетку, она «чувствует», что что-то находится на ее оболочке, и поглощает это с помощью обычного эндоцитоза, то есть окружает частицу и «поедает», захватывая внутрь. Затем вирус попадает в лизосому — специальный пузырек с агрессивной кислотной средой, в котором происходит дефрагментация внешних частиц на будущий строительный материал для клетки.

Но вирус гриппа оказался хитрым. Он не разрушается в этих пузырьках благодаря белку, который умеет сливать его мембрану с мембраной лизосомы, и активируется именно в кислой среде. Получается, что мембраны вируса и лизосомы сливаются как два воздушных пузыря, после чего генетический материал вируса выбрасывается в клетку.

Во втором случае оболочка вируса сливается сразу с клеточной мембраной по тому же принципу, как это происходит с лизосомой, после чего его генетический материал и белки мигрируют непосредственно внутрь клетки. Так действует ВИЧ. Этот процесс очень отдаленно похож на слияние жировых пятен в супе. Обычно клеточные мембраны не сливаются, иначе жизнь на Земле была бы невозможна, поэтому вирус создал специальный механизм. Он очень близко подводит свою липидную мембрану к липидной мембране клетки и за счет специальных белков немного раздвигает липиды оболочки. Так вирусный геном попадает в клетку.

Когда генетический материал вируса оказывается в клетке, он ведет себя по-разному в зависимости от его структуры. Репликация генома у большинства ДНК-содержащих вирусов происходит в клеточном ядре. РНК-вирусы, как правило, реплицируются в цитоплазме. Но есть исключение — РНК-содержащие ретровирусы, способные к обратной транскрипции. Для репликации такие вирусы используют промежуточную стадию в виде ДНК-молекулы. На вирусной РНК строится одиночная цепочка ДНК, а затем дополняется комплементарной цепочкой и встраивается прямо в хромосомы хозяина, ничем не отличаясь от генов, которые мы унаследовали от родителей. После этого новые вирионы (вирусные частицы) появляются благодаря работе этого нового «гена».

Например, SARS-CoV-2 никак не взаимодействует с генетическим материалом клетки и находится только в цитоплазме, где происходит репликация его РНК и строятся необходимые вирусу белки. Там же происходит сборка новых вирионов, которые затем выходят из клетки. Вирус иммунодефицита человека тоже содержит РНК, но относится к ретровирусам, то есть его геном встраивается в клеточную хромосому.

Цикл жизни

Цикл жизни вирусов состоит из нескольких этапов, являющихся обязательными:

1. Адсорбция на клетке носителя. Это первоначальный и важный этап распознания клеток-мишеней по рецепторам. Адсорбция может происходить на клетках органов или тканей. Процесс запускает механизм дальнейшей интеграции вируса в клетку. Для связывания клеток требуется определенное количество ионов. Это необходимо для снижения электростатического отталкивания. Если проникновение в клетку не удается, вирус ищет новую мишень для интеграции и процесс повторяется. Это явление объясняет определенность в путях проникновения вируса в организм человека.

Так, например, слизистая оболочка верхних дыхательных путей обладает рецепторами к вирусу гриппа. Клетки кожи, напротив, таковых не имеют. По этой причине невозможно заразиться гриппом через кожный покров, это возможно только при вдыхании частиц вируса. Бактериальные вирусы в форме нитей или не имеющие отростков не могут прикрепляться на стенках клетки, поэтому они адсорбируются на фимфибриях. На начальном этапе адсорбция происходит за счет электростатического взаимодействия. Данная фаза обратима, так как частица вируса легко отделяется от клетки, выбранной в качестве мишени. Начиная со второй фазы, отделение не представляется возможным.

2. Следующая стадия размножения ДНК-содержащих вирусов характеризуется попаданием целого вириона или нуклеиновой кислоты, им выделяемой внутри клетки носителя. В организм животного вирус интегрируется проще, так как клетки в данном случае не снабжены оболочкой. Если у вириона есть снаружи липопротеидная мембрана, то она сталкивается при контакте с аналогичной защитой клетки носителя и вирус попадает в цитоплазму. Вирусы, проникающие в бактерии, растения и грибы интегрируются сложнее, так как в данном случае они вынуждены проходить сквозь жесткую стенку клетки. Для этого бактериофаги, к примеру, обеспечены ферментом лизоцимом, который помогает растворить твердые клеточные стенки. Примеры ДНК-содержащих вирусов рассмотрим ниже.

3. Третья стадия именуется депротеинизацией. Она характеризуется высвобождением нуклеиновой кислоты, являющейся носителем генетической информации. У некоторых вирусов, например, бактериофагов, данный процесс сочетается со второй стадией, так как белковая оболочка вириона остается за пределами клетки носителя. Вирион способен проникать в клетку путем захвата последней. При этом возникает вакуоль-фагосома, которая вбирает в себя первичные лизосомы. При этом расщепление на ферменты происходит только у белковой части вирусной клетки, а нуклеиновая кислота остается в неизменном состоянии. Именно она в дальнейшем существенно переформирует функционирование здоровой клетки, вынуждая ее производить нужные вирусу вещества. Сам вирус необходимыми для таких процедур механизмами не обеспечен. Существует такое понятие, как стратегия вирусного генома, которая подразумевает реализацию генетической информации.

4. Четвертая стадия размножения ДНК-содержащих вирусов сопровождается выработкой нужных для жизнедеятельности вируса веществ, которая осуществляется под влиянием нуклеиновой кислоты. Сначала вырабатывается ранняя мРНК, которая станет основой для белков вируса. Ранними называются молекулы, которые возникли до высвобождения нуклеиновой кислоты. Молекулы, возникшие после репликации кислоты, называют поздними

Важно понимать, что выработка молекул напрямую зависит от вида нуклеиновой кислоты конкретного вируса. ДНК-содержащие вирусы во время биосинтеза придерживаются определенной схемы, включающей конкретные этапы – ДНК-РНК-белок

Мелкие вирусы используют в процессе транскрипции РНК-полимеразы. Крупные, такие как оспяной вирус, синтезируются не в клеточном ядре, а в цитоплазме.

К ДНК-содержащим вирусам относятся вирусы гепатита В, герпес, вирусы оспы, паповавирусы, гепаднавирусы, парвовирусы.

Группы РНК-вирусов

Вирусы, содержащие РНК, подразделяются на несколько групп:

1. Первая группа устроена наиболее просто. В нее входят корона-, тога- и пикорнавирусы. Транскрипция у этих видов вируса не осуществляется, поскольку однонитчатая РНК вириона самостоятельно реализует функцию матричной кислоты, то есть представляет собой основу для выработки белков на уровне клеточных рибосом. Таким образом, схема биовыработки у них выглядит как РНК-белок. Вирусы данной группы называют также позитивно геномными или плюснитевыми.

2. Вторая группа ДНК и РНК-содержащих вирусов включает в себя минуснитевые вирусы, то есть они обладают негативным геномом. Это вирусы кори, гриппа, паротита и многие другие. В них также содержится однонитчатая РНК, но она не подходит для непосредственной трансляции. По этой причине сначала происходит перенос данных на РНК вириона, а полученная матричная кислота будет служить в дальнейшем основой для выработки белков вируса. Транскрипция в данном случае определяется зависимой от рибонуклеиновой кислоты полимеразой РНК. Данный фермент приносится вирионом, так как он отсутствует в клетке изначально. Это связано с тем, что у клетки не возникает необходимости перерабатывать РНК для получения другого РНК. Так, схема биовыработки в данном случае будет выглядеть как РНК-РНК-белок.

3. Третью группу составляют так называемые ретровирусы. Они же входят в разряд онковирусов. Биосинтез у них происходит по более сложному пути. В исходной матричной РНК однонитчатого типа на начальном этапе происходит выработка ДНК, что является уникальным явлением, аналогов которому нет в природе. Процесс находится под контролем специального фермента, а именно зависимой от РНК полимеразой ДНК. Данный фермент также носит название ревертазы или обратной транкриптазы. Молекула ДНК, полученная в результате биосинтеза, получает форму кольца и обозначается как провирус. Далее молекула внедряется в клетки хромосом носителя и транскрибируется несколько раз посредством полимеразы РНК. Созданные копии совершают следующие действия: представляют собой матрицу РНК, с помощью которой вырабатывается вирусный белок, а также вирион РНК. Схема синтеза представляется таким образом: РНК-ДНК-РНК-белок.

4. Четвертая группа образуется из вирусов, РНК которых имеет двухнитчатую форму. Их транскрипция реализуется посредством фермента вируса зависимой РНК полимеразы РНК.

5. В пятой группе выработка составляющих частицы вируса, а именно капсидных белков и нуклеиновой кислоты происходит многократно.

6. Шестая группа включает в себя вирионы, которые возникают как результат самосборки на основе множества копий белков и кислоты. С этой целью концентрация вирионов должна достичь критического значения. При этом компоненты частицы вируса вырабатываются отдельно друг от друга в разных областях клетки. Сложные вирусы также создают защитную оболочку из веществ, входящих в плазменную клеточную мембрану.

7. На заключительном этапе новые частицы вируса высвобождаются из клетки носителя. Данный процесс происходит разными способами в зависимости от вида вируса. Некоторые клетки после этого погибают, так как клеточный лизис освобождается. В других вариантах возможно отпочковывание от клетки, однако и этот способ не предотвращает ее дальнейшее отмирание, так как повреждается мембрана плазмы.

Период до момента выхода вируса из клетки называют латентным. Продолжительность данного промежутка может находиться в пределах от нескольких часов до пары дней.

Мы построили им рай

Пожалуй, главное оружие вирусов — это способность чрезвычайно быстро меняться. В частности, у ВИЧ это свойство обусловлено тем, что фермент обратная транскриптаза делает ошибки при копировании вируса в организме. Как будто полиция ищет преступника по фотороботу и отпечаткам, а он каждый день меняет свой облик. У других вирусов есть свои механизмы изменчивости. Благодаря им, к примеру, вирус Эбола за двадцать лет с момента открытия изменился на целую четверть.

Этот процесс называется рекомбинацией вирусов — вирусы обмениваются своими генами друг с другом, создавая новые виды. Такая рекомбинация может происходить как между разными ДНК, так и разными РНК. Причем участвует в обмене генетический материал не только вирусов, но и их носителей — к примеру, может соединяться вирус животного и человека. Именно так появляются новые опасные формы вирусов.

Но почему именно сегодня новые вирусы появляются все чаще? Профессор Института молекулярной биологии и генетики, академик Виталий Кордюм называет несколько основных причин, главные из них — сомкнутость популяции, когда происходит тесный контакт людей при их большом количестве, и возможность быстрого перемещения носителей вируса. Благодаря научному и техническому прогрессу носитель опасной инфекции за несколько суток может добраться с одного континента на другой. Этот же прогресс стал причиной того, что последние 70 лет происходит односторонняя миграция населения из сел и малых городов в крупные города, что привело к возникновению компактных многомиллионных поселений.

Научная классификация SARS-CoV-2:

Домен: Вирусы Тип: — Класс: — Порядок: Nidovirales (Нидовирусы) Семейство: Coronaviridae (Коронавирусы) Подсемейство: Orthocoronavirinae (Ортокоронавирусы) Род: Betacoronavirus (Бетакоронавирусы) Подрод: Sarbecovirus Штамм: SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) Международное научное название: SARS-CoV-2 (изначально — 2019-nCoV)

Группа по Балтимору IV: (+)оцРНК-вирусы.

SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), он же 2019-nCoV (2019-Novel Coronavirus) – штамм коронавируса, из рода бетакоронавирусов (Betacoronavirus), обнаруженный в конце 2019 года у больных с пневмонией в Китае и по состоянию на начало 2020 года получивший широкое распространение по всему миру.

Другие названия SARS-CoV-2 — 2019-nCoV, Уханьский коронавирус, Wuhan coronavirus, Wuhan seafood market pneumonia virus, китайский коронавирус.

По структуре — SARS-CoV-2 является одноцепочным РНК-содержащим вирусом, который вызывает заболевания дыхательной системы человека. В связи с этим, главные клинические проявления китайского коронавируса – выраженное воспаление, покраснение и отечность в дыхательных путях, что при осложненном течении может приводить к пневмонии, удушью и летальному исходу. Среди же симптомов преобладают — лихорадка, слабость, кашель, головная и мышечная боль.

Лечение основывается преимущественно на поддержании функционирования жизненно-важных органов. Специфические противовирусные препараты находятся в разработке.

Классификация

Класс I: вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК

Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК для репликации попадают в ядро клетки, так как им требуется клеточная ДНК-полимераза. Также репликация ДНК этих вирусов сильно зависит от стадии клеточного цикла. В некоторых случаях вирус может вызывать деления клетки, что может приводить к раковому перерождению. Примерами таких вирусов являются Herpesvirales, Adenoviridae, Papillomaviridae и Polyomaviridae.

У представителей семейства Poxviridae геномная ДНК реплицируется не в ядре.

Класс II: вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК

Вирусы семейств Circoviridae и Parvoviridae реплицируют геномную ДНК в ядре и в ходе репликации образуют интермедиат — двуцепочечную ДНК.

Класс III: вирусы, в которых РНК способна к репликации (редупликации)

Как и большинство РНК-вирусов, представители класса III реплицируют геномную РНК в цитоплазме и используют полимеразы хозяина в меньшей степени, чем ДНК-вирусы. Класс III включает в себя два крупных семейства — Reoviridae и Birnaviridae. Репликация моноцистронная, геном сегментирован, каждый ген кодирует один белок.

Классы IV и V: вирусы, содержащие одноцепочечную РНК

Классы IV и V включают вирусы двух типов, репликация которых не зависит от стадии клеточного цикла. Наряду с вирусами, содержащими двуцепочечную ДНК, эти вирусы наиболее изучены.

Класс IV: вирусы, содержащие одноцепочечную (+)РНК

Непосредственно на (+) геномной РНК вирусов IV класса может идти синтез белка на рибосомах клетки хозяина. Вирусы классифицируют на две группы, в зависимости от особенностей РНК:

• у вирусов с полицистронной мРНК трансляция приводит к образованию полипротеина, который затем разрезается на зрелые белки. С одной цепи РНК может синтезироваться несколько разных белков, что снижает длину генов.
• вирусы со сложной трансляцией — синтез белка идет со сдвигом рамки считывания, также используется протеолитический процессинг полипротеинов. Эти механизмы обеспечивают синтез разных белков с одной цепи РНК.

Вирусы данного класса включают в таксоны: Nidovirales, Picornavirales (Picornaviridae), Tymovirales, Astroviridae, Caliciviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Virgaviridae и др.

Класс V: вирусы, содержащие одноцепочечную (−)РНК

Геномные РНК вирусов класса V не могут быть транслированы на рибосомах клетки хозяина, предварительно требуется транскрипция вирусными РНК-полимеразами в (+)РНК. Вирусы пятого класса классификации по Балтимору классифицируют на две группы:

• вирусы, содержащие несегментированный геном, на первом этапе репликации происходит транскрипция (−)РНК вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой в моноцистронную мРНК, и далее синтезируются дополнительные копии (+)РНК, служащие матрицами для синтеза геномных (−)РНК. Репликация геномных РНК таких вирусов осуществляется в цитоплазме.
• вирусы с сегментированными геномами, репликация геномных РНК которых происходит в клеточном ядре, вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует моноцистронные мРНК с каждого сегмента генома. Наибольшим отличием данной группы вирусов от другой группы пятого класса состоит в том, что репликация осуществляется в двух местах.

Представители данного класса входят в состав таксонов: Bunyavirales, Mononegavirales, Arenaviridae, Ophioviridae, Orthomyxoviridae и Deltavirus.

Класс VI: вирусы, содержащие одноцепочечную (+)РНК, реплицирующиеся через стадию ДНК

Наиболее хорошо изученным семейством данного класса вирусов, являются ретровирусы. Вирусы класса VI используют фермент обратную транскриптазу для превращения (+)РНК в ДНК. Вместо использования РНК в качестве матрицы для синтеза белков вирусы этого класса используют РНК как матрицу ДНК, которая встраивается в геном хозяина ферментом интегразой. Дальнейшая репликация происходит при помощи полимераз клетки хозяина. Наиболее хорошо изученным представителем данной группы вирусов является ВИЧ.

Небольшая группа вирусов, в состав которой входят семейства Caulimoviridae и Hepadnaviridae, в том числе вирус гепатита B. Имеют двуцепочечную геномную ДНК, которая ковалентно замкнута в форме кольца и является матрицей для синтеза мРНК вируса, а также субгеномных РНК. Субгеномная РНК служит матрицей для синтеза ДНК-генома ферментом обратной транскриптазой вируса. В некоторых источниках группу называют параретровирусами.